WB實(shí)驗是分子生物學(xué)中最為常見(jiàn)的實(shí)驗，那么你知道影響WB實(shí)驗的因素有什么嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、蛋白樣本制備

1. 蛋白質(zhì)的樣品制備注意以下問(wèn)題：

（1）在合適的條件下，保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復性。

（2）選擇合適的表面活性劑和還原劑，使其形成各自多肽的溶液。

（3）盡量去除核酸，多糖，脂類(lèi)等分子的干擾，裂解完畢離心之后取中層澄清溶液時(shí)避免吸到底層沉淀和上層脂類(lèi)。

（4）整個(gè)制作蛋白樣本的制備過(guò)程必須在低溫下進(jìn)行，避免細胞破碎釋放出各種酶類(lèi)，但是注意不要反復凍融。

（5）所抽取樣品的蛋白含量，蛋白變性是否充分等等，還有，蛋白樣品的pH值是否在7~8之間。這會(huì )直接影響到樣品濃縮的效果。此外，蛋白樣品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都會(huì )對最終結果的可靠性有影響。

2. 小分子量蛋白10KD需要的注意點(diǎn)

（1）可選擇孔徑0.22μm的PVDF膜或者NC膜，轉膜時(shí)間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系；

（2）也可以選擇PSQ膜，同時(shí)縮短轉移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移，其他按步驟即可。

3. 大分子量蛋白200KD需要的注意點(diǎn)：

（1）做200kd蛋白的WB時(shí)要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；

（2）轉移時(shí)間需要相應延長(cháng)；要做分子量參照（否則出現雜帶不知道如何分析）；

（3）轉膜液中甲醇含量可適當降低，推薦使用濕裝轉膜效率更高。

二、凝膠的配制

制膠關(guān)鍵是聚合時(shí)間，分離膠聚合控制在從加入10%AP和TEMED至開(kāi)始凝膠，時(shí)間為10—20分鐘(未wan全凝聚)，濃縮膠最佳聚合時(shí)間為8-10min，可通過(guò)控制AP和TEMED量來(lái)控制。

1. 凝膠質(zhì)量

不連續SDS-PAGE膠對凝膠的要求較高，分離膠的pH值應在8.8左右，而濃縮膠的pH應在6.8左右，最好不要差過(guò)0.5個(gè)pH單位，因為這個(gè)pH條件是保證電泳液中的甘氨酸不電離的必要條件，也是保證能充分壓縮樣品的前提。

因此，制備凝膠的時(shí)候所用Tris-HCl緩沖液的pH值是否穩定是很重要的。

2. 在用ddH2O壓分離膠的時(shí)候為什么經(jīng)常存在中間凸的現象？

（1）加水時(shí)不能對著(zhù)膠沖，要沿著(zhù)玻璃板緩慢流行；

（2）加水滿(mǎn)后一定要保證上方水平面是平齊的；

（3）加膠要避免氣泡，也要避免加膠太慢而提前凝固等現象；

三、電泳

1. 應待凝膠充分凝固后電泳，或者催化劑加入后充分混勻，否則條帶容易中間凹陷兩邊翹起。

2. 兩板玻璃之間排除所有的氣泡，防止條帶中間鼓兩邊下陷。

3. 加樣前離心，選擇適當的樣本緩沖液（盡量用新鮮配制的，這樣能保證pH值和離子強度的穩定），加適量的樣品促溶劑，防止wb條帶拖尾或蛋白出現紋理。

4. 常用濃縮時(shí)80V，分離時(shí)100V比較好，條帶很平。

更多有關(guān)WB實(shí)驗的影響因素，請聯(lián)系北京百奧創(chuàng )新科技有限公司。